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發酵罐生物反應器

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生物反應器是國產高端生物藥研發的基石

2022-6-20
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生物反應器是指利用為細胞或細菌等微生物進行生化反應提供良好反應環境的設備。生物反應器中的微生物處在一個穩定的培養環境中,並能得到培養介質的循環供給。生物反應器的設計與開發除需符合GAMP5與ASME BPE等標準的相關規定外,還需了解所選用的pH、溫度、氧需求、生長率等微生物培養條件,以及最終產品的表達和濃度。
生物反應器裝備裝有很多在位傳感器和一個界麵友好、變量操控靈活的數字控製係統,允許控製許多可變量參數,包括溫度、攪拌轉速、pH、溶解氧的濃度等。理想的高性能生物反應器應具有非常低的全混時間以及非常高的氣液傳遞等特征,除了監控參數外,高性能生物反應器還配置了在線分析儀對重要的培養變量進行頻繁監控。圖1是一個典型的生物反應器係統示意圖,該設備的重要培養變量能夠高頻率計量(30~1000 h-1),其它培養參數則可以較低頻率自動取樣測量(1~3 h-1)。

生物反應器可以實現質量穩定的連續培養,並對進料流量進行測量,它能夠以不同的稀釋倍率(精度在0.005 h-1)工作,通過培養基補料的適當設計可實現利用單一的組件完成諸如葡萄糖或氨等進液的操作。生物反應器具有氣體混合後的通氣功能,通過混合進氣比例的變化對過程產生影響,例如,生長中的氧濃度以及產品動力學可提供在同一特定生長率的研究。利用計算機對培養參數的控製,可以對工藝進行高重複性的實驗,對細胞反應基質是一個極為重要的了解手段。  
生物反應器的生物安全等級(BL)由最終用戶依照相關標準製定,各房間的操作要求(例如取樣廢氣排放,凝聚物和培養基廢棄處理)都要保證操作者和環境的安全。根據病原對微生物活細胞的危險,生物安全等級(BL)分成3個安全等級空間,包括BL1-LS、BL2-LS和BL3-LS,病原危險越高、在設計和設備運行時要求房間的安全等級就越高。對於等級BL2和BL3的產品,添加輔料、取樣和收獲需使用密閉操作係統,汙染凝聚物需收集到指定的滅活罐進行後續處理,培養結束後,生物反應器的罐體和管道需得到及時的清洗與滅菌處理。為避免取樣操作帶來雜菌汙染,側壁取樣閥需采用封閉的取樣裝置(圖2)。       
製造生物反應器的罐體材料分為高分子、玻璃或不鏽鋼,高分子材質的生物反應器為一次性產品,玻璃材質罐體可以經高壓滅菌,而不鏽鋼罐體通過蒸汽在線消毒。

生物反應器一般為圓柱體,安裝有攪拌器、夾套和絕緣層,大小從幾升到幾千升不等,罐體夾套用於維持最佳培養溫度。由於通氣、攪拌及泡沫的影響,罐體中液位以上的頂部空間常為工作體積的 20~30%;為滿足在線滅菌的要求,生物反應器設計壓力為-1~3bar,工作溫度為143℃;設備內表麵拋光度為電拋光Ra<0.4μm,以保證產品接觸表麵易於清洗;罐體的開孔數量、位置與類型取決於培養過程的原輔料添加(酸堿度、溫度控製媒介、消泡劑和培養基等)和總預期的儀表控製(壓力、液位、溫度、pH和O2探頭等),圖4是生物反應器罐體的通用設計要求。 
高徑比是罐體工作高度與內徑的比例,大的高徑比意味著更優的氧和熱傳遞。耗氧發酵每分鍾需要消耗大約液體體積1~1.5倍體積的氣體,因此,要求罐體寬高比大於1.5,而且為了達到高的氧傳遞,攪拌係統一般選用多個葉輪,較低位置的葉輪用於產生徑向流並保證足夠的剪切分散空氣氣泡;上部的葉輪能產生軸向流並進行大工作量的攪拌。通常,底部與上部葉輪之間的距離為罐體直徑的2/3。為產生適合大量攪拌的軸向流,以及由於細胞敏感性限製的低剪切力,細胞生物反應器的罐體高徑比要求為1:1,攪拌係統需選用單一的葉輪。 
攝氧速率(OUR)是指維持細胞生長及單位細胞量必需的氧氣量,OUR可以通過實驗獲得。首先測量飽和發酵培養基中溶解氧,然後測量微生物耗完氧氣的速率;氧傳遞速率(OTR)是指氧氣由氣相傳遞至液相的速率。通常情況下,生物反應器的設計要求能提供足夠的氧,而沒必要在必需時給生物體(尤其是在指數生長期)提供最大的氧氣量。由於OTR受攪拌程度和通氣量的影響,因此,在生物反應器放大時需要考慮如下幾個因素: 
通氣量:如果空氣中氧含量低於21%,可以輸入純氧作為氣源; 
攪拌功率:加大輸入功率可以保證更多的氧由氣相傳遞至液相; 
壓頭:壓頭增加可以增加OTR,同時還能避免泡沫的產生; 
分布器的類型和位置:安裝於最低葉輪下麵的分布器可向生物反應器中輸入空氣或無菌氣體,其最佳的安裝位置為葉輪直徑的3/4,如果分布器的位置距離葉輪太遠,空氣氣泡就會在散開之前重新聚合。 
模塊化設計能提前繪製焊點圖,具有按圖組裝、質量穩定、即插即用、能滿足工廠測試FAT、節省占地麵積、美觀大方、形式多樣且便於操作等優點。生物反應器需按照3D設計圖紙進行組裝(圖5),每套設備均可按照客戶實際需求進行量身定製。
生物發酵的在線檢測技術及控製是非常重要的過程,菌體製備、初級或次級代謝產物以及轉化技術都是在人為給予最佳環境的培養條件下實現的。對微生物生長的外部物理條件、化學條件以及物料中生物學條件的調控是一個複雜的過程工程,目的是利於產物的生成。 
發酵參數檢測反饋的大量信息有助於更好地理解培養過程,並對工藝進行優化和改進。生物發酵工程需要測量控製的物理參數包括攪拌轉速、罐壓、物料溫度、通氣量、發酵液總質量、粘度、進液流量與累積量等;生物發酵工程需要測量控製的化學參數包括pH、pO2、CO2粘度、Kla氧呼吸速率、碳源、氮源、菌體濃度、尾氣排放氧/二氧化碳分壓、呼吸商以及酶的比活力、物料消耗速率與產物生成速率等。 
發酵液pH的精確控製對細胞生長及產物的形成非常重要,發酵過程中,細胞或基質的消耗會導致培養液發生pH變化。生物反應器使用可耐受高溫滅菌的pH傳感器,多為組合式探頭,由玻璃電極和參比電極組成(帶有內部電解液與參比電解液),在線測量通過電極側麵多孔塞上的液體結合點與培養液接觸。pH電極的測量範圍為0~14,精度±0.01~0.05。pH傳感器的電極內容物會隨高溫滅菌以及使用時間不斷變化,每批次發酵滅菌前後均需用標準緩衝液給予校準。
培養液的溶解氧濃度(DO)直接影響細胞的生長,溶氧濃度過低會限製細胞供養速率,導致生長速率降低與代謝流向的改變。發酵中隨著細胞的生長,菌體濃度增大,使得呼吸和耗氧速率加快,這一過程需要加大攪拌速率、通氣量預計OTR氧傳導速率。以基因重組大腸杆菌的流加培養為例,在一定速率的葡萄糖流加條件下,通過係統控製不斷給予正/負脈衝信號對流加速度進行連續的修正。可通過觀察溶氧濃度的瞬時脈衝響應,將葡萄糖濃度大致控製在臨界值範圍之內,使細胞生長速度處於最佳狀態,並對其代謝副產物給與抑製。發酵中常用的極譜電極為電化學測量方式,即使用隻有O2可滲透的膜將發酵液與電化學電池分隔,DO傳感器主要結構包括膜、電解液膜、陰極、絕緣體、陽極和電解液等。 現代發酵工業的生化反應過程控製完全依賴於計算機控製係統的應用,通過可靠的數據采集係統對生產過程進行實時操控和優化,保障整個生產過程不出現偏差。計算機的過程信息數據儲存功能可以方便進行工藝數據比較分析,可在線校正傳感器信息與識別傳感器性能的變化。目前,生物發酵工業化生產過程計算機控製是集散型控製係統(DCS),DCS集中了連續控製、批量控製、順序邏輯控製與數據采集功能的計算機綜合控製管理係統。